Le 8 octobre 1517, François Ier signe la charte de fondation de la ville. La « grosse tour » en défend l’entrée. Le site est entouré de marais, et il n’est pas question à l’origine de créer une ville dans ce milieu insalubre. Pourtant, sur l’initiative de Du Chillou, François Ier donne exemption de taille et de franc-salé aux futurs habitants du Havre. Les armes de la ville sont celles de François Ier : une salamandre. Le roi se déplace lui-même en août 1520 et rend les privilèges du Havre (essentiellement le quartier Notre-Dame) perpétuels, essentiellement des exonérations d’impôts.
En juin 1523, Giovanni da Verrazano part du Havre à bord de la Dauphine pour les Indes Occidentales et découvre le site de New York qu’il nomme Nouvelle Angoulême en hommage à François Ier le commanditaire de l’expédition.
Le 12 juillet 1555, une expédition de 600 hommes dirigée par Villegagnon part du Havre pour fonder une colonie protestante au Brésil (Fort-Coligny). Aujourd’hui encore, une place des cannibales rappelle ces liens anciens avec le Nouveau Monde. D’autres convois de huguenots embarquent au Havre pour l’Amérique.
En février 1562, une expédition quitte le port du Havre en direction de la Floride. Elle est dirigée par Jean Ribault et René de Laudonnière, avec 150 hommes, en majorité des protestants.
À la fin du XVIe siècle, le trafic avec le Nouveau Monde prend son essor et Le Havre voit arriver des produits américains comme des cuirs, du sucre et du tabac. Un des principaux acteurs de ce négoce est un Havrais explorateur et cartographe, Guillaume Le Testu (1509-1573) : un quai au Havre porte toujours son nom. D’autres figures de la Course et de l’exploration de l’Amérique passèrent par Le Havre : le capitaine Guillaume de Champaigne (années 1550-1580), le Normand Pierre Belain d’Esnambuc (1585-1637) qui prit possession de l’île antillaise de Saint-Christophe en 1626. Jacques Devaux est né au Havre ; il fut pilote et cartographe et en 1579 il explora la région de l’Amazone et fit des relevés des côtes américaines de 1585 à 1587.